УКРОЩЕНИЕ ВИРУСА

19-07-2023

Вирусы всем известны как возбудители болезней. Но первая из изобретенных вакцин (против оспы) это тоже живой вирус. Полная ликвидация оспы на земном шаре - его заслуга. Обычно вакцинный вирус - близкий родственник болезнетворного, однако, попав в организм, он вызывает только специфический иммунитет, а не заболевание.

Более века назад Л. Пастер придумал, как превратить опаснейший возбудитель бешенства в живую вакцину (хотя о том, что этот возбудитель - вирус, он не догадывался, поскольку вирусы в то время еще не были открыты). Пастер несколько раз подряд размножил (пропассировал) этот возбудитель на мало чувствительных к нему кроликах. Идея была проста: "привыкая" (адаптируясь) к новому необычному "хозяину", вирус как бы "отвыкает" от старых (в том числе от человека) и теряет по отношению к ним агрессивность. Ослабление болезнетворных свойств вируса (аттенуация) путем пассирования на маловосприимчивых хозяевах до недавнего времени было по существу единственным "работающим" способом получения живых противовирусных вакцин.

Что же конкретно происходит с вирусами при их аттенуации? На этот вопрос ответа не было, да и сейчас в большинстве случаев нет. Чтобы ответить, нужно глубже понимать характер взаимоотношений между вирусом, с одной стороны, и заражаемыми им клеткой или организмом, с другой. Необходимо также лучше разбираться в молекулярных механизмах жизнедеятельности здоровой клетки. Эта медаль имеет и другую - практическую - сторону: расшифровка механизмов вирусной аттенуации позволит создавать совершенно новые вакцины, которые по своим свойствам могут превосходить все то, чего можно достичь, идя за Пастером. Одно из свойств, которое требует особого внимания, - генетическая стабильность аттенуированного вируса. Ведь как вакцинный вирус "отвык" от человека, так в результате применения на людях он может к человеку опять "привыкнуть". Возврат болезнетворных свойств (реверсия) - серьезная проблема при разработке и применении живых противовирусных вакцин.

Основной научный интерес нашей группы - молекулярные механизмы размножения вирусов и некоторые важные стороны жизнедеятельности здоровой клетки. Но так получилось, что при изучении этих механизмов мы в последние годы постоянно сталкивались с проблемой аттенуации вирусов.

Синтез белков пикорнавирусов

Вирусы, с которыми мы сейчас работаем, - это вирус полиомиелита и вирус энцефаломиелита мышей (вирус Тейлера). Оба объекта входят в группу сходно устроенных, относительно мелких вирусов, которые называют пикорнавирусами. К этой же группе принадлежат вирусы ящура, гепатита А, некоторые возбудители простудных заболеваний и ряд других агентов. Вирус полиомиелита вызывает, главным образом у детей, поражения центральной нервной системы (преимущественно спинного мозга), часто проявляющиеся в виде хромоты из-за паралича некоторых мышц. Вирус Тейлера, если его ввести в мозг мыши, приводит к развитию заболеваний, напоминающих некоторые другие тяжелые нервные болезни человека. Генетический материал (геном) обоих вирусов - молекула РНК (а не ДНК, как у всех клеток), которая в данном случае представляет собой цепочку примерно из 8 тыс. звеньев - нуклеотидов (в состав РНК входит четыре варианта нуклеотидов). Их последовательность в геноме наших вирусов известна.

После попадания в клетку любой вирус должен наладить производство деталей, из которых затем будет собрано новое поколение вирусных частиц. Для этого прежде всего надо образовать вирусные белки. Синтез белков, как вирусных, так и клеточных, осуществляют специальные внутриклеточные аппараты - рибосомы. Программа, которая определяет последовательность аминокислот в синтезируемом белке, задается молекулами РНК; в случае наших вирусов - это их геномная РНК, в клетке же - разнообразные так называемые матричные РНК (мРНК). РНК вирусов полиомиелита и Тейлера отличаются от основной массы клеточных мРНК не только закодированной в них аминокислотной последовательностью, но и способом, при помощи которого эта информация становится доступной для рибосомы [1, 2].

Ключевая проблема при синтезе белка (трансляции) - начать этот процесс, а далее он пойдет более или менее автоматически. Считается, что синтез клеточных белков обычно начинается с присоединения рибосомы к специальной химической группировке ("кэпу"), находящейся на одном из концов мРНК (назовем его "левым"). Далее рибосома передвигается "вправо", достигает последовательности, кодирующей белок (как правило, расположенной не очень далеко от "левого" конца молекулы), и начинает собственно трансляцию. У пикорнавирусов такой стандартный механизм не может осуществиться: в их РНК просто нет кэпа и, кроме того, очень длинный (около 10% всех нуклеотидов) "левый" нетранслируемый конец молекул РНК содержит препятствия для передвижения рибосомы.

Для ее присоединения к молекулам пикорнавирусных РНК в их составе есть особая структура, обозначаемая IRES (от англ. Internal Ribosome Entry Site - место внутреннего связывания рибосомы). Это несколько сотен нуклеотидов сегмента РНК, предшествующего участку, который кодирует вирусные белки. Работами нашей лаборатории показано, что существуют по крайней мере два различных способа организации IRES в геномах пикорнавирусов [3-5]. Пространственная укладка цепочки РНК сохраняется у разных представителей данной подгруппы вирусов, несмотря на заметные вариации последовательности нуклеотидов. Вирус полиомиелита попадает в одну подгруппу, а вирус Тейлера - в другую (рис.1).

Присоединение к РНК - условие, необходимое, но не достаточное для того, чтобы рибосома начала считывать содержащуюся в этой РНК информацию. Трансляция практически всегда начинается с определенной тройки (триплета) нуклеотидов - AUG, которая кодирует аминокислоту метионин. В геномах всех пикорнавирусов соответствующий триплет находится примерно на одинаковом расстоянии (20-25 нуклеотидов) от IRES. Очень важное значение имеет окружение этого триплета: синтез белка может начаться только в том случае, если у AUG подходящие соседи. Так, в РНК вируса Тейлера ближайший к IRES AUG имеет "приличное" окружение и поэтому служит для инициации синтеза белка. В геноме вируса полиомиелита ситуация иная: здесь соседи AUG, располагающегося вслед за IRES, - "неподходящие", и синтез белка начинается намного "правее", на следующем AUG, которому более "повезло" с соседями.

Однако и у полиовируса AUG, находящийся рядом с IRES, хотя и "молчит", но важную работу все-таки выполняет. При помощи специальной "хирургической" (генно-инженерной) операции мы меняли (удлиняли или укорачивали) расстояние между IRES этого вируса и следующим за ним "молчащим" AUG [6, 7]. В ряде случаев вирус после операции не погибал, но инвалидом обычно становился: его способность к размножению резко падала. Однако после нескольких пассажей в культивируемых вне организма клетках измененные (мутантные) вирусы по эффективности размножения мало отличались от своего "нормального" родителя. У восстановивших здоровье вирусов мы обнаружили удивительное разнообразие в "оперированном" районе РНК. Тем не менее это разнообразие можно было свести к трем группам изменений. В первой были вирусы с заменами отдельных нуклеотидов: в результате этих замен возникал новый AUG на подходящем расстоянии от IRES. В другой группе нормальное расстояние между IRES и родительским "молчащим" AUG восстанавливалось за счет вставок (если после операции расстояние было уменьшено) или потерь (при увеличенном расстоянии) нуклеотидов. Наконец, исследовав третью группу, мы неожиданно обнаружили, что излечение вируса, у которого были удалены восемь нуклеотидов из участка между IRES и "молчащим" AUG, происходило из-за дополнительной потери полутора сотен нуклеотидов, но только при условии, что инициаторный (т. е. находящийся в благоприятном окружении) AUG был на нужном расстоянии от IRES. Таким образом, опыты говорили, насколько важно, чтобы AUG располагался в данном месте, а каково окружение этого триплета, будет ли он "молчащим" или инициаторным - вопрос второй. Однако, как показали дальнейшие исследования, этот второй вопрос тоже крайне важен.

Аттенуация вируса полиомиелита

Все слышали о вакцине против полиомиелита. Она представляет собой три аттенуированных штамма (разновидности) вируса, которые в 50-х годах получил американский ученый А. Сэбин, следуя по дороге, проторенной Пастером. Каждый штамм защищает от определенного варианта "дикого" вируса. Вакцина эта очень эффективна и практически безопасна. Имея столь мощное защитное средство, Всемирная организация здравоохранения была вправе задаться целью полностью ликвидировать полиомиелит на Земле к 2000 г.

Исследователи ряда лабораторий (и нашей в том числе) пытались понять природу отличий штаммов Сэбина от их агрессивных родителей. Последовательность нуклеотидов в РНК вакцинных штаммов отличается от таковой родительских вирусов по многим позициям, но лишь немногие из этих различий имеют отношение к снижению болезнетворности. Поэтому в лаборатории очень легко получить реверсию (возврат биологических свойств мутантного вируса) сэбиновских штаммов к вирулентности. Реверсии могут происходить также при производстве вакцины (разумеется, существует необходимый контроль) и даже при ее применении (здесь тоже есть способы избежать неприятностей). Тем не менее вакцинные штаммы генетически нестабильны.

Аттенуирующие мутации располагаются в разных участках вирусного генома и затрагивают разные свойства вируса. При этом одна группа нуклеотидных замен находится внутри IRES и, как было показано в нашей лаборатории, снижает эффективность инициации трансляции [8, 9]. Отсюда и появилась гипотеза о том, что аттенуация вируса полиомиелита (ослабление его вирулентности для нервных клеток) может в определенной степени быть обусловлена дефектом в синтезе вирусных белков. Но поскольку в культурах клеток вакцинные варианты размножаются вполне эффективно, мы предположили, что трансляционные дефекты аттенуирующих мутаций штаммов Сэбина должны особенно сильно проявляться в нервных клетках. Это предположение получило экспериментальные подтверждения [10].

Вернемся к AUG и его окружению, а конкретно - к тем ревертантам вируса полиомиелита, которые самопроизвольно "выбросили" значительный кусок своей РНК, расположенный "справа" от IRES, чтобы избавиться от причиненной им инвалидности. Казалось странным, что в утерянном куске есть элементы, которые в обязательном порядке присутствуют у всех вирусов, родственных полиовирусу: ведь эволюционная консервация обычно указывает на функциональную важность. Натолкнувшись на такой факт, мы подумали, что хороший рост ревертантов в культивируемых вне организма клетках еще не следует принимать за полноценность вирусов. Ведь эволюция "подгоняла" вирусный геном к размножению отнюдь не в искусственных условиях. Было решено проверить, как влияет отсутствие значительного куска РНК на поведение вируса в нервной системе [11]. Об этом можно судить по способности вируса вызывать параличи, но тут возникли технические препятствия. Дело в том, что до недавнего времени проверять вирулентность полиовируса можно было только на обезьянах. А это - большой дефицит. Однако при помощи специальных генетических операций можно научить полиовирус заражать и мышей. Не описывая, как это делается, скажем, что в поставленных опытах утеря протяженного сегмента РНК "справа" от IRES, мало влияя на способность полиовируса размножаться в культуре клеток, резко снижала его вирулентность для мышей. Заметим, что вся эта работа проводилась с вирусами, у которых не было аттенуирующих мутаций, характерных для штаммов Сэбина.Какой же конкретно участок утерянного сегмента РНК определяет вирулентность вируса? Были сконструированы РНК, в которых отсутствовал не весь этот сегмент, а только отдельные его компоненты, и вирулентность таких мутантов была проверена на мышах. В итоге мы пришли к заключению, что главная причина аттенуации ревертантов - это близость IRES к инициаторному AUG и отсутствие между ними (на нужном расстоянии от IRES) "молчащего" AUG. Напомним, что "молчащий" и инициаторный AUG различаются нуклеотидным окружением. О значении этого факта мы еще поговорим, а сейчас лишь отметим, что вирусы с протяженными нехватками (делециями) генетического материала не только высоко аттенуированы, но и генетически стабильны. Самостоятельно вернуть себе вирулентность они не могут из-за протяженности утерянного сегмента генома.

Аттенуация вируса Тейлера

Из опытов с вирусом полиомиелита мы знали, что на определенном расстоянии вслед за IRES должен находиться AUG и что убирать его с этого места ни под каким видом нельзя. У вируса Тейлера соответствующий триплет имеет "хороших", инициаторных соседей. Было решено повторить с РНК вируса Тейлера "полиомиелитные опыты" [12]. В участок между IRES и инициаторным триплетом встроили синтетический фрагмент РНК. Нас ждал сюрприз: вирусы, у которых в обязательном, как мы предполагали, месте AUG отсутствовал, прекрасно размножались в культуре клеток. Эта способность не нарушалась даже, если AUG был удален от IRES более чем на сотню нуклеотидов.Однако, когда мы проверили нейровирулентность сконструированных мутантов, они оказались глубоко аттенуированными [13]. Если мышки и заболевали после введения большой дозы вируса, это было обусловлено появлением в мозгу ревертантов, у которых восстанавливались необходимые пространственные взаимоотношения между AUG и IRES. Далее, во вставку, отделявшую инициаторный AUG от IRES, мы помещали AUG в неблагоприятном окружении. Наличие "молчащего" AUG сопровождалось некоторым повышением вирулентности, которая, однако, оставалась значительно ниже, чем у исходного агрессивного родителя. Оказалось также, что по влиянию на вирулентность различные неинициаторные соседи значительно различаются между собой. При одном окружении мыши, получившие относительно большую дозу вируса, с определенной вероятностью заболевают, причем развивается паралич всех четырех лап, и болезнь почти неминуемо заканчивается смертью (рис.2). Другие мутанты, у которых AUG также был "молчащим", но находился в другом окружении, вызывали заболевания примерно с такой же частотой, однако болезнь протекала значительно легче: паралич затрагивал чаще только задние ноги, и многие мыши не только выживали, но и избавлялись от параличей. Стоит добавить, что все эти модификации вирусного генома практически не сказывались на способности вирусов расти в культивируемых клетках.

Таким образом, наличие или отсутствие AUG на определенном расстоянии от IRES, а также окружение этого AUG драматическим образом сказываются на нейровирулентности двух пикорнавирусов, причем по- разному. К аттенуации вируса полиомиелита ведет замена "молчащего" AUG на инициаторный, а вируса Тейлера, наоборот, - замена инициаторного на "молчащий" или еще лучше - удаление AUG на большое расстояние от IRES (такое вмешательство убивает вирус полиомиелита). Из этих и некоторых сходных наблюдений (которые нет возможности описать из-за вынужденной краткости изложения) вытекают серьезные следствия, главные из которых стоит хотя бы перечислить.

1. Поскольку изменения в районе, примыкающем к IRES, могут резко снижать вирулентность вируса, мало сказываясь на его способности размножаться в тканевых культурах, появляется возможность рационального конструирования аттенуированных штаммов [14]. По сравнению с классическим способом адаптации к чужеродному хозяину, такой инженерный подход имеет определенные преимущества, основное из которых - возможность создавать генетически стабильные вакцинные штаммы.

2. Описанные выше факты указывают на то, что имеются различия в чувствительности трансляционного аппарата разных клеток к изменениям в регуляторных элементах вирусных РНК. Мы располагаем и более прямыми свидетельствами того, что такие различия действительно существуют. Это означает, что разные клетки как бы пользуются разными диалектами одного и того же языка. "Лингвистические" предпочтения вряд ли касаются только вирусных РНК. Можно полагать, что клеточная дифференцировка (возникновение разнообразия клеток в процессе развития из оплодотворенной яйцеклетки) сопровождается и частично вызывается характерными изменениями в специфичности узнавания клеточных мРНК.

3. Поскольку минимальные изменения на небольшом участке вирусного генома могут кардинально менять его вирулентность - от способности неумолимо парализовать и убивать свою жертву до практически 100%-ной аттенуации с полным спектром клинических картин у промежуточных вариантов, возникает потребность в соответствующем совершенствовании способов идентификации вирусов. Применяемые в настоящее время методы не приспособлены для такого анализа.

Автор: В. И. Агол

По материалам сайта "www.elibrary.ru"

Другие статьи по теме: