У Вас есть удачное изобретение?

Публикуйте концепцию и возможно инвестор заметит Вас!

Клетки крови, такие как переносящие кислород эритроциты или обеспечивающие противоинфекционную защиту лейкоциты, живут недолго: в течение нескольких дней (лейкоциты) или месяцев (эритроциты). Основная масса клеток крови представлена конечными, не способными к делению клетками, поэтому в течение всей жизни новообразование клеток крови происходит в специальном кроветворном органе - костном мозге. У взрослого человека объем крови составляет около 5 л, а в 1 мл крови содержится около 5 млрд эритроцитов и 5 млн лейкоцитов. Процесс кроветворения исключительно интенсивен, и в ходе его производится поистине астрономическое число клеток - более 300 млн в минуту, а за год жизни у человека образуется около 200 трлн клеток крови.

Клетка не может возникнуть из "ничего" или, например, из смеси входящих в ее состав компонентов (нуклеиновых кислот, белков и др.). Она образуется только путем деления из клеток-предшественников, которые находятся в костном мозге [1]. Здесь есть не только условия для размножения и созревания клеток крови, но и происходит регуляция процесса кроветворения гормонами - регуляторами клеточного роста (как стимулирующих, так и тормозящих размножение клеток). Таким образом костный мозг обеспечивает образование огромного количества клеток нужного вида, в нужное время и в нужном месте.

Как происходит работа этой замечательной клеточной фабрики? Возникло предположение, что в кроветворной системе существует клетка- предшественник, которая в отличие от всех других соматических клеток, бессмертна, т. е. способна в результате деления образовывать дочерние клетки, не отличающиеся от родительской всеми свойствами, включая способность к неограниченному размножению.

Всего в костном мозге образуются клетки восьми основных клеточных линий, каждая из которых имеет своих родоначальников, способных формировать клетки только данного направления развития (дифференцировки). Такие клетки, обладают ограниченной способностью к размножению и относительно быстро (обычно в течение дней, реже - немногих недель) созревают до конечных клеток со специализированной функцией. Одно из крупнейших достижений гематологии последних лет - доказательство существования единого предшественника для всех ныне известных клеток крови. Такой предшественник был назван стволовой кроветворной клеткой (СКК), по аналогии со стволом дерева, из которого развиваются все его ветви [1, 2].

Однако оставалось неясно, действительно ли СКК способна "самоподдерживаться", т. е. воспроизводить новые идентичные родительским клеткам СКК и тем самым бесконечно поддерживать сколь угодно интенсивное кроветворение.

Наиболее убедительные данные могли быть получены при наблюдении за поведением в организме индивидуальных СКК, для чего необходимо уметь отличать одну СКК (и ее потомство, клеточный клон) от другой. Успехи молекулярной биологии привели к развитию метода маркирования индивидуальных СКК путем переноса в них чужеродного гена. Осуществляется такой перенос с помощью специально сконструированного вируса, не способного к размножению (репликационно дефектного), но который может встраиваться в определенный фрагмент (сайт интеграции) ДНК клетки. В каждой клетке содержится несколько тысяч таких участков [3].

После введения облученной мыши генетически маркированного костного мозга и "восстановления" ее за счет СКК донорского происхождения, в кроветворной системе обнаруживается только один-два клеточных клона (популяции клеток, имеющие общего предшественника), которые легко выявляются как в крови, так и на всех кроветворных территориях - в костном мозге, селезенке, тимусе. Эти данные еще раз доказали полипотентность СКК, ее способность производить клетки самых различных клеточных линий.

Второй важный результат этих исследований: установлено, что клетки интенсивно мигрируют в различные участки кроветворной системы, в результате чего потомство одной СКК расселяется по всей системе и поддерживает в ней продукцию кроветворных клеток. В серии экспериментов через несколько месяцев после восстановления костный мозг переносили к следующему, вторичному облученному реципиенту. У него через длительные сроки можно было обнаружить тот же маркерный клон, который обеспечивал кроветворение у первичного реципиента. Отсюда следует, что даже одна СКК может обеспечить длительное, в течение всей жизни мыши, поддержание продукции кроветворных клеток. С практической точки зрения можно считать, что речь идет действительно о клетке, обладающей бесконечным пролиферативным потенциалом, т. е. способностью к неограниченному по времени размножению и продукции сколь угодно большого числа клеток крови. Это очень редкая категория клеток, которая встречается в костном мозге в концентрации около 1:100 тыс. клеток. Из полученных результатов следует, что в организме существуют бессмертные соматические стволовые клетки, способность к самоподдержанию которых и обеспечивает целостность организма, благодаря продукции огромного числа зрелых клеток, заменяющих погибшие в результате старения [4].

Тем не менее результаты этих исследований остаются все же малопонятными. Почему в организме обнаруживается только один клон кроветворных клеток? Можно предположить, что процедуру переноса гена выдерживают лишь очень немногие СКК и реально каждая мышь получает лишь одну-две полноценные СКК. Однако это не так. Независимо от дозы вводимых клеток, которая отличалась в 20 раз, функционировали только один-два клона. Если ввести такую клеточную взвесь 20 мышам, у каждой из них обнаружится только один клон, одна функционирующая СКК, причем у всех животных эти клоны различны. Если эту же взвесь клеток ввести одной мыши, у нее может быть выявлен только один клон, одна СКК. Куда же девались по меньшей мере еще 19 СКК? Почему все они могут быть активированы при первом переносе (если ввести их 20 мышам), тогда как при втором обнаруживается только одна, даже если костный мозг такой восстановленной мыши вводился пяти вторичным реципиентам? С другой стороны, при использовании методов, не связанных с маркированием кроветворных клеток, было показано, что кроветворение носит поликлональный характер и одновременно функционируют много клонов. В чем причина столь существенных различий в результатах?

Дело в том, что работы с маркированными стволовыми клетками имеют ряд серьезных методических ограничений. Прежде всего, для изучения кроветворных тканей мышь приходится умерщвлять, и подлинной динамики индивидуального клона СКК установить не удается, всегда речь идет о "фотографии", о состоянии кроветворной системы в момент неестественной гибели животного. Во-вторых, чувствительность метода относительно невелика, маркерный клон можно обнаружить лишь, если его размер составляет не менее 10% от взятых в анализ клеток, откуда следует, что все относительно меньшие клоны просто ускользают от определения. И, наконец, процесс переноса маркерного гена требует, чтобы СКК в момент переноса находились на стадии синтеза ДНК (иначе вирус не встраивается в геном), т. е. размножались (пролиферировали). Между тем при нормальном кроветворении подавляющее большинство СКК не пролиферирует, и для эффективного вирусного переноса гена приходится насильственно вызывать вступление клеток в период синтеза ДНК. Для стимуляции пролиферации СКК их культивируют с огромными нефизиологическими концентрациями ростовых факторов (обычно используют комбинацию фактора стволовых клеток с интерлейкинами IL-3, IL-6 - гормонами, регулирующими деление и созревание клеток и др.). Не очень ясно, как такие воздействия меняют свойства СКК после трансплантации.

В нашей лаборатории была создана методология, которая впервые позволила изучать динамику клонов в процессе кроветворения, причем на новом микроуровне, когда исследованию подвергаются не миллионы клеток, а только одна. Нам удалось устранить или значительно смягчить дефекты ранее применявшихся методов (рис.1). Во-первых, для избежания возможных артефактов, связанных с воздействием больших концентраций ростовых факторов [5] перед переносом гена кроветворные клетки помещали на облученный подслой стромальных (строящих и составляющих микроокружение) клеток длительной культуры костного мозга. Такая система моделирует кроветворное микроокружение облученного реципиента, и стимуляция СКК достигается физиологическими концентрациями ростовых факторов, продуцируемых стромальными клетками. Во-вторых, был разработан метод получения костного мозга из бедра живой, находящейся под наркозом мыши. Благодаря тому, что костный мозг бедра полностью регенерирует за два месяца, можно проследить динамику индивидуальных клонов на протяжении всей жизни "восстановленной" мыши, повторно отбирая у нее костный мозг каждые три месяца. В-третьих, была увеличена примерно в миллион раз чувствительность метода. С этой целью мы изучали не только суммарную ДНК, выделенную из костного мозга бедра, как это делалось прежде, но и вводили часть клеток другим мышам - вторичным облученным реципиентам, для получения колоний в селезенке. Каждая селезеночная колония представляет собой клеточный клон, развившийся из одного предшественника (раннего потомка СКК), который получил название колониеобразующая единица селезеночная (КОЕс). Через 11 дней из селезенки этих реципиентов вырезали индивидуальные колонии, в ДНК клеток которых и определяли наличие чужеродного гена. Таким образом, чувствительность использованного метода позволяет определить одну клетку, одну КОЕс, а не несколько сотен тысяч клеток, как при обычном методе изучения суммарной ДНК из кроветворного органа.

Полученные результаты неожиданно выявили совершенно новую картину кроветворения. Прежде всего оказалось, что на протяжении всей жизни "восстановленной" мыши кроветворение поддерживается многими одновременно функционирующими клонами, число которых составляет несколько десятков (рис.2, рис.3, рис.4). Продолжительность жизни индивидуального клона невелика - обычно не превышала трех месяцев. Как правило, клональный состав кроветворной ткани полностью менялся в течение трех месяцев, и только очень редкие клоны (примерно 10%) существовали дольше, т.е. выявлялись в двух анализах, произведенных с интервалом в три месяца. Из 250 изученных нами клонов ни один не сохранялся в течение шести месяцев. Исчезнувшие клоны никогда не появлялись вновь, что говорит об истощении в процессе кроветворения исходной для данного клона стволовой клетки. Как правило, размер клона был очень невелик, и обнаруженные при анализе индивидуальных клеток (КОЕс) клоны не выявлялись при тотальном анализе того же образца костного мозга. Отсюда следует, что индивидуальный клон обычно состоит из 0.5-1 млн зрелых клеток, а это - предел чувствительности ранее использованного метода анализа, поэтому такая множественность кроветворных клонов не была обнаружена прежде. Никогда кроветворение не было представлено только одним или двумя клонами, заселяющими все кроветворные территории. Более того, выяснилось, что различные кроветворные органы обычно заселены разными клонами. Например, набор клонов оказывался различным в бедре, голени, селезенке и тимусе. Только некоторые клоны достигали существенной величины и могли быть выявлены более чем в одном кроветворном органе, например в тимусе и бедре, в селезенке и бедре, но никогда нам не удалось наблюдать клеточный клон, представленный во всех кроветворных тканях.

Таким образом, хотя и существуют гигантские клоны, заселяющие всю кроветворную систему, как это было показано другими исследователями [4], подавляющее большинство клонов - небольшие и локально расположенные. Отсюда следует, что интенсивность обмена кроветворными клетками между различными участками кроветворной системы существенно меньше, чем предполагалось раньше: эти клетки не мигрируют постоянно в костном мозге, а функционируют локально и выходят в кровь, как правило, в виде зрелых клеток. Видимо, даже кратковременное разобщение СКК с регулирующей сетью, кроветворного микроокружения оказывает негативное влияние, которое проявляется, например, в том, что выходящие в кровь СКК обладают сниженным репопуляционным потенциалом и способностью восстанавливать кроветворную систему, что было показано нами ранее при сравнении циркулирующих в крови СКК с их костномозговыми аналогами.

Другой важный результат этих исследований заключается в изменении наших представлений о числе кроветворных клеток, способных к длительному функционированию в организме облученного животного. Мы обнаружили несколько десятков кроветворных клонов (50-100) - потомков тех маркированных СКК, которые существовали в момент восстановления облученной мыши. При этом изучали кроветворные клоны только в двух бедрах мыши, в которых содержится около 10% всех кроветворных клеток. Исследование ограничивалось периодом в 14 месяцев, что составляет половину продолжительности жизни мыши. Следовательно, в вводимой дозе костного мозга содержалось не менее 1-2 тыс. полипотентных СКК, способных к длительному поддержанию кроветворения. Так как мы вводили не более 5% всех кроветворных клеток, то общее содержание СКК у мыши составляет 20-40 тыс. и их концентрация в костном мозге (в нем содержится около 200 млн клеток) составляет 1:5-10 тыс., т. е. в 10-20 раз выше той, которая предполагалась ранее.

Главный же результат этой работы - установление факта отсутствия у стволовых клеток способности к самоподдержанию. Они закладываются в эмбриогенезе и расходуются последовательно, образуя короткоживущие, локально расположенные, сменяющие друг друга клеточные клоны, аналогично тому, как это происходит в яичнике. С теоретической точки зрения, это очень важный результат. Трудно представить себе, что какие- либо соматические клетки действительно имеют неограниченный пролиферативный потенциал. Ведь бессмертие клетки сильно повышает вероятность ее малигнизации (перерождения в опухолевую), и достаточно только одной поломки механизма, регулирующего клеточное размножение, чтобы СКК превратилась в лейкозную клетку. Ограниченный пролиферативный потенциал СКК объясняет, почему они не превращаются в злокачественные с частотой, в сотни тысяч раз большей реально наблюдаемой.

Вместе с тем такое устройство кроветворной системы имеет и очевидный биологический смысл. В случае повышенного запроса на кроветворение можно гораздо быстрее удовлетворить его за счет созревания многих предшественников, обладающих чувствительностью к запросу, чем начинать ответ с немногих СКК, которым нужно длительное время (не менее 3-4 недель) для созревания до стадии КОЕс.

Можно думать, что исследования ближайших лет позволят выяснить, насколько такая модель кроветворения реализуется в нормальном организме, без привнесения таких искажающих результаты воздействий, как культивирование клеток, введение в них чужеродного гена, трансплантация их в облученный организм.

Автор: И. Л. Чертков, Н. И. Дризе

Введите ваше имя:

Комментарий:

Защита от спама - введите символы с картинки (регистр имеет значение):